Аллогенные мезенхимальные стволовые клетки пуповины человека для лечения расстройств аутистического спектра у детей
Расстройства аутистического спектра (РАС) у детей представляют собой серьезные отклонения в развитии, которые оказывают влияние на их общение, поведение и социальное взаимодействие. Эти нарушения вызывают у семей и специалистов постоянные поиски эффективных методов лечения, которые могли бы улучшить качество жизни детей с РАС. Одним из перспективных направлений в современной медицине являются стволовые клетки при аутизме, которые привлекают внимание благодаря своим уникальным свойствам.
Научные исследования показывают, что у детей с РАС часто наблюдаются нарушения иммунной регуляции и воспалительные процессы. В связи с этим возникает необходимость поиска методов, которые могли бы справиться с этими сопутствующими проблемами. В последние годы особый интерес вызывают мезенхимальные стволовые клетки, полученные из ткани пуповины (UC-MSC). Эти клетки известны своими иммуномодулирующими и противовоспалительными свойствами, что позволяет использовать их для лечения различных заболеваний.
Стволовые клетки помогают не только в лечении многих болезней, но и открывают новые горизонты в терапии аутизма. Несколько исследований уже подтвердили безопасность применения UC-MSC для лечения различных состояний, что дает надежду на их эффективное использование в терапии РАС. В частности, в новом исследовании, проведенном учеными из Республики Панама, изучалась безопасность и эффективность применения стволовых клеток при аутизме у детей.
Исследователи стремились выяснить, как именно UC-MSC могут повлиять на состояние детей с РАС, и какие результаты можно ожидать от такой терапии. Этот подход основан на способности стволовых клеток модулировать иммунную систему и снижать воспалительные процессы, что может способствовать улучшению поведенческих и коммуникативных навыков у детей с аутизмом.
Таким образом, стволовые клетки при аутизме представляют собой многообещающий метод, который может значительно улучшить жизнь детей с РАС и их семей. Исследования в этой области продолжаются, и каждый новый шаг приближает нас к пониманию того, как стволовые клетки помогают в борьбе с этим сложным расстройством.
Люди с расстройствами аутистического спектра (РАС)страдают отклонениями в развитии, которые влияют на общение, поведение и социальное взаимодействие. Нарушение иммунной регуляции и воспаление связаны с РАС у детей. Мезенхимальные стволовые клетки, полученные из ткани пуповины (UC-MSC), обладают иммуномодулирующими и противовоспалительными свойствами и были безопасно использованы для лечения различных состояний.
Результаты оценивали с помощью контрольного списка оценки лечения аутизма (ATEC)и шкалы оценки детского аутизма (CARS), а также с помощью измерений уровней MDC и TARC в сыворотке крови. Двадцать пациентов получали дозу 36 миллионов внутривенных UC-MSC каждые 12 недель (четыре раза в течение 9-месячного периода) и находились под наблюдением через 3 и 12 месяцев после завершения лечения. Побочные явления, связанные с лечением, были легкими или умеренными и непродолжительными. Баллы CARS и ATEC у восьми испытуемых снизились в течение курса лечения, что переводит их в более низкую категорию симптомов РАС по сравнению с исходным уровнем. Уровни воспалительных цитокинов MDC и TARC также снизились у пяти из этих восьми пациентов. Средние значения MDC, TARC, ATEC и CARS достигли самых низких уровней через 3 месяца после последнего введения. Таким образом, введение UC-MSC детям с РАС было признано безопасным.
Введение
Дети с расстройствами аутистического спектра (РАС) сталкиваются с нарушениями развития, которые существенно влияют на их общение, поведение и социальные взаимодействия. Клиническая картина РАС может сильно варьироваться в зависимости от выраженности симптомов, но у детей с этим расстройством обычно наблюдаются повторяющиеся модели поведения и речи, а также дефицит социального взаимодействия и вербального/невербального общения. Кроме того, часто встречаются сопутствующие проблемы, такие как тревожность, синдром дефицита внимания/гиперактивности, двигательные нарушения (например, гипотония, неуклюжесть, ходьба на носках), нарушения сна (например, бессонница), умственная отсталость и желудочно-кишечные проблемы (например, хронические запоры, диарея, боли в животе).
Аутизм, который примерно в четыре раза чаще встречается у мальчиков, чем у девочек, за последние годы значительно увеличился в распространенности, что создало значительное экономическое бремя на систему специального образования, здравоохранение и привело к потере производительности родителей. Современные методы лечения этого состояния ограничены психологическими вмешательствами и альтернативными методами (поведенческая, когнитивная и речевая терапия), а также лечением симптомов с помощью фармакотерапии, таких как селективные ингибиторы обратного захвата серотонина (СИОЗС) и антипсихотические препараты, которые могут вызывать побочные эффекты, включая экстрапирамидные симптомы, седативный эффект и увеличение веса. Несмотря на рост числа случаев и финансовые и социальные последствия, эффективность этих вмешательств часто оказывается ограниченной, что подчеркивает необходимость в биологических подходах, нацеленных на клеточные и молекулярные механизмы РАС.
Исследования показывают, что у детей с РАС наблюдаются нарушения регуляции иммунитета, выражающиеся в измененных ответах Т-клеток, повышенных уровнях цитокинов в плазме и значительно более низких уровнях трансформирующего фактора роста β-1. В частности, у детей с РАС часто отмечаются кишечная иммунная дисрегуляция и воспаление, сопровождающиеся окислительным стрессом, апоптозом и высокой секрецией продуктов распада амилоидного белка. Связь между воспалением и аутизмом подтверждается исследованием Аль-Айяди и Мостафы, которое показало, что у детей с РАС уровни хемокинов, происходящих из макрофагов и регулируемых тимусом и активацией, значительно выше, чем у нейротипичных детей. Более того, у людей с тяжелым аутизмом уровни этих показателей в сыворотке были значительно выше, чем у людей с легким и умеренным аутизмом, что указывает на важность дальнейшего изучения иммунных механизмов в контексте РАС.
Материалы и методы
В этом одногрупповом клиническом исследовании фазы I/II с участием 20 субъектов с РАС участники получали одну серию лечения каждые 12 недель, всего четыре серии лечения в течение 9 месяцев (фаза лечения). Затем за субъектами наблюдали в течение 1 года с оценкой через 3 и 12 месяцев после последнего лечения (12-месячные и 21-месячные визиты соответственно). В каждый момент времени проводились полные медицинские и психиатрические обследования, общий анализ крови, полная метаболическая панель и тесты на инфекционные заболевания, уровни сывороточных цитокинов (MDC и TARC) и опросники, специфичные для аутизма (CARS и контрольный список для оценки лечения аутизма [ATEC]). на этапах лечения и последующего наблюдения.
Во время первого визита, на первой неделе, участники были оценены на предмет исходных значений безопасности и эффективности и получили 36 миллионов ЯК-МСК внутривенно в течение 1 недели в виде четырех внутривенных инфузий по 9 миллионов жизнеспособных ЯК-МСК в каждой инфузии. Двенадцать недель спустя, на 13-й неделе, субъекты получили ту же дозу UC-MSC и были оценены на предмет безопасности и эффективности. Эту процедуру повторяли на 25-й и 37-й неделе после начала лечения. Суммарная доза, полученная за курс лечения, составила 144 миллиона ЯК-МСК (4 × 36 миллионов). На этапе наблюдения визиты происходили на 49 неделе (12 месяцев после начала лечения, 3 месяца после последней дозы) и 89 неделе (21 месяц после начала лечения, 12 месяцев после последней дозы).
Исследование было одобрено Панамским институциональным наблюдательным советом (Comité Nacional de Bioética de la Investigación) и зарегистрировано в базе данных Национальной медицинской библиотеки США Национальных институтов здравоохранения (идентификатор ClinicalTrials.gov NCT02192749). Исследование спонсировалось Translational Biosciences. Все виды лечения проводились в Институте стволовых клеток в Панама-Сити, Республика Панама, по номеру протокола TBS-UCMSC-ASD001. Письменное информированное согласие было получено для всех участников исследования и доноров пуповины.
Субъектная популяция
Дети в возрасте 6–16 лет, ранее не проходившие терапию стволовыми клетками, рассматривались для участия в этом исследовании, если у них ранее был диагностирован аутизм в соответствии с «Руководством по диагностике и статистике психических расстройств», 4-е издание, что подтверждено Графиком диагностического наблюдения за аутизмом или диагностическим интервью по аутизму.
Подходящие кандидаты должны были передвигаться, быть в состоянии сидеть неподвижно не менее 5 минут, иметь адекватное зрение, слух и координацию рук и пальцев (т. е. уметь указывать), а также иметь нормальный уровень свинца и ртути в сыворотке крови. уровни при скрининге и отсутствие других неконтролируемых медицинских расстройств. Из исследования были исключены недоношенные дети (<32 недель беременности) или значительно маленькие для гестационного возраста дети, а также дети с умственной отсталостью, судорожными расстройствами, аутоиммунными заболеваниями или травмами головы в анамнезе. Кроме того, кандидаты не считались подходящими, если они недавно внесли или ожидали каких-либо изменений в своем обычном лечении или диете.
Подготовка и культура UC-MSC
UC-MSC, использованные в этом исследовании, были выделены из ткани UC человека из добровольно пожертвованных UC, полученных от нормальных здоровых новорожденных после тщательного процесса скрининга. Вкратце, матерям в возрасте 18–35 лет на момент родов была предоставлена стандартная анкета для оценки риска, а донор был проверен на инфекционные заболевания (включая вирус иммунодефицита человека (ВИЧ) [1+2]-Ab и ВИЧ). [1+2] Ag-Ab, V.D.R.L., гепатит B (HB)sAg и HB-anti-core/IgG-IgM, цитомегаловирус IgM, вирус гепатита A-IgM, вирус гепатита C-Ab, Chagas-Ab, человеческий T- лимфотропный вирус [1+2]-Ab и токсоплазмоз IgM [это заболевание, эндемичное для Панамы, регулярно сканируется в рамках стандартного лечения]). Клетки, использованные в этом исследовании, были произведены MediStem Panama, биотехнологической лабораторией, расположенной в Международном научно-технологическом парке «Города знаний», Панама, в соответствии с передовой производственной и лабораторной практикой.
UC-MSC были получены путем ферментативного расщепления желе UC Wharton с использованием 1,67% коллагеназы (Sigma, C9891, Сент-Луис, Миссури, США) при 37 ° C. После выделения клетки размножали до пассажа с использованием α-MEM (Gibco, 32561-102, Карлсбад, Калифорния, США) с добавлением 4 мМ GlutaMax (Gibco, 35050-079, Карлсбад, Калифорния, США) и 10% инактивированного фетального бычья сыворотка (Gibco, 16000044, Гранд-Айленд, Нью-Йорк, США). Флаконы, содержащие только UC-MSC, были криоконсервированы с использованием 6% гидроксиэтилкрахмала (Claris, G/LVP-5, Ellisbridge, Ахмадабад, Индия), содержащего 10% диметилсульфоксида (Sigma, D2650, Ирвин, Великобритания), сначала охлажденного при -80°С. Ультраморозильник °C со скоростью примерно 1°C/мин от 25°C до −80°C в морозильном контейнере (Nalgene, 5100‐0001, Рочестер, штат Нью-Йорк, США), а затем погружается непосредственно в газовую фазу жидкого азота.
Их содержали на карантине до тех пор, пока путем тестирования случайных флаконов одной и той же партии не было подтверждено их соответствие требованиям по жизнеспособности (до замораживания и после оттаивания), стерильности, микоплазме, эндотоксину, характеристике и дифференциации. Перед каждой обработкой клеточные флаконы отбирали в соответствии с общим количеством жизнеспособных клеток, полученным при контроле качества после замораживания и оттаивания (после процедуры подготовки шприца), чтобы иметь дозу клеток, требуемую протоколом. После промывания после оттаивания дозу корректировали так, чтобы как можно точнее достичь целевого показателя лечения в 9 миллионов клеток на инфузию.
Флаконы размораживали в контролируемых условиях и готовили к соответствующей лечебной дозе 2,25 миллиона клеток на миллилитр, суспендировали в 4 мл растворе (1 мл 5% декстрозы и 3 мл стерильного 0,85% физиологического раствора), всего 9 миллионов жизнеспособных клеток. за инфузию. Процедуры проводились при строгом соблюдении асептической техники для обеспечения стерильности приготовленного шприца и по результатам контроля качества флаконов для обеспечения жизнеспособности клеток. Каждый шприц проверяли на отсутствие комков клеток, целостность контейнеров и правильный объем.
Этикетки были проверены на предмет прослеживаемости по предоставленным документам сертификата анализа партии и цепочки поставок. Методики жизнеспособности, характеристики и дифференциации были проверены как внутри компании, так и в сторонней независимой лаборатории. Клетки подсчитывали и жизнеспособность измеряли с использованием проточного цитометра с реагентом Guava ViaCount (MerckMillipore, 4000-0041, Хейворд, Калифорния, США) в течение времени от 0 до 4 часов при комнатной температуре (20–24°C). После приготовления шприцев клетки вводили менее чем за 2 часа, поскольку исследование стабильности после оттаивания показало, что это оптимальный порог для сохранения стабильности. Только клетки с жизнеспособностью после оттаивания ≥75% (средняя жизнеспособность 86,5%, стандартное отклонение 3,63%, коэффициент дисперсии 4,20%, медиана 88,0%, минимум 76,8%, максимум 93,6%); отрицательный для аэробов, анаэробов и микоплазмы; с уровнем эндотоксина ≤ 3,0 ЕЭ/мл; ≥95% положительных результатов на маркеры клеточной поверхности CD90, CD73 и CD105; отрицательный результат по маркерам клеточной поверхности CD34 и CD45 согласно критериям Международного общества клеточной терапии для MSC 43; и обладавшие способностью дифференцироваться в адипоциты, хондроциты и остеоциты использовались в клинической практике.
Конечные точки исследования
Безопасность, основная конечная точка этого исследования, оценивалась в шесть различных моментов времени в ходе исследования посредством полного психиатрического и медицинского обследования, лабораторных исследований безопасности (общий анализ крови, полная метаболическая панель и тесты на инфекционные заболевания), возникновения нежелательных явлений и серьезных нежелательные явления и их связь с исследуемым продуктом.
Сигналы эффективности оценивались по результатам, сообщаемым родителями, с помощью инструментов CARS и ATEC 44 в сотрудничестве с детским психиатром, участвовавшим в исследовании, который оценивал внешний вид, поведение, настроение, речь и интеллектуальное функционирование субъектов в дополнение к родительским отчетам. Второй набор показателей эффективности, уровни MDC и TARC в сыворотке, измерялся с помощью иммуноферментного анализа в двух экземплярах сервисным подразделением RayBiotech, Inc. Оптическую плотность измеряли для определения средней концентрации на миллилитр.
Статистический анализ
Данные были проанализированы с использованием программного обеспечения IBM SPSS версии 25. Среднее значение, стандартное отклонение, минимальное и максимальное значения были рассчитаны для уровней MDC и TARC, а также показателей CARS и ATEC в шесть различных моментов времени: неделя 1 (T1, базовый уровень), неделя 13 (T2). , вторая серия лечения), 25-я неделя (Т3, третья серия лечения), 37-я неделя (Т4, четвертая серия лечения), 49-я неделя (12-месячный визит) и 89-я неделя (21-месячный визит). Отсутствующие данные были проанализированы, чтобы определить, отсутствовали ли данные полностью случайным образом, с использованием теста Литтла MCAR.
Для замены пропущенных значений использовался алгоритм EM с максимум 25 итерациями. Чтобы определить, имело ли лечение значительный терапевтический эффект, был проведен тест на разницу повторных измерений, многомерный дисперсионный анализ (MANOVA), чтобы определить, наблюдались ли значительные изменения в средних значениях MDC, TARC, ATEC и CARS при любом из шесть временных точек для участников, у которых был полный набор данных. Для всех анализов использовался уровень значимости p < .05.
Полученные результаты
В период с марта 2015 г. по декабрь 2015 г. в это исследование были включены двадцать субъектов различной национальности. Большинство из них (95%) были мужчинами, а средний возраст участников составил 10,25 лет. Средние исходные показатели CARS и ATEC составляли 37,48 и 61,10 соответственно, а средние уровни MDC и TARC в сыворотке до лечения составляли 949,60 и 212,35 соответственно. Из включенных субъектов 16 завершили все четыре серии лечения, указанные в протоколе исследования; Всего было проведено 296 инфузий. Субъекты получили общую дозу 36 миллионов UC-MSC в каждый момент времени лечения (в среднем 36,1 миллиона, стандартное отклонение 0,06, коэффициент дисперсии 0,16%, медиана 36,1, минимум 36,03, максимум 36,16), всего 144 миллиона в течение курса лечения. лечение (в среднем 144,3 миллиона, стандартное отклонение 0,19, коэффициент дисперсии 0,13%, медиана 144,3, минимум 144,07, максимум 144,73) для тех, кто завершил серию лечения (n = 16).
Пятнадцать субъектов находились под наблюдением до конца периода исследования (пятеро не завершили его: два субъекта прекратили лечение после двух серий лечения из-за того, что их родители были серьезно больны и не могли соблюдать учебные визиты, двое детей прекратили лечение по личным причинам после завершения три серии лечения, и одна была потеряна для наблюдения после завершения всей фазы лечения). В ходе теста Литтла MCAR было обнаружено, что недостающие данные полностью отсутствуют случайно (χ 2 [131] = 121,60, p = ,71). Число субъектов, получивших лечение и имевших полностью полный набор конечных точек эффективности (все показатели CARS, показатели ATEC, уровни MDC и TARC в сыворотке) во все моменты времени исследования, составило 10.
В ходе данного исследования не наблюдалось серьезных нежелательных явлений (СНЯ), связанных с лечением. Был один случай кризиса агрессии, который потребовал госпитализации у пациента с документально подтвержденной историей тяжелой агрессии до включения в исследование. Всего за 296 инфузий было зарегистрировано 133 нежелательных явления, из которых 58 (19,6%) были расценены как связанные с лечением ЯК-МСК. Большинство нежелательных явлений (НЯ), наблюдавшихся в ходе исследования (56,4%), были квалифицированы как «не связанные» или «маловероятно связанные» с лечением ЯК-МСК. Два субъекта сообщили о легком воспалении, отеке и/или покраснении в месте инфузии как о кратковременных и исчезнувших самостоятельно, и было установлено, что они «определенно связаны» с лечением.
НЯ, которые считались «возможно связанными» с лечением, включали умеренное усиление тиков, обсессивно-компульсивное поведение и агрессию, о которых сообщили шесть субъектов, а также легкую усталость, головную боль, лихорадку и увеличение гиперактивности или тревоги. На протяжении всего исследования не наблюдалось клинически значимых изменений в основных гематологических и химических лабораторных тестах.